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关键词: 细胞生物学 考试方法 改革策略
细胞生物学作为生物学相关专业的基础课程,其考核环节一直为我国高校相关专业所重视。传统细胞生物学课程的考试环节主要以闭卷检测作为考核方式,以考试分数作为标准对学生的学习能力及学习成绩进行评定。这种考核方法难以有效地反映学生的综合素质,因此对细胞生物学课程考试方法进行改革具有一定的必要性。
一、细胞生物学课程考试改革的原则与思路
(一)考试方法改革原则
由于细胞生物学课程专业性及理论性较强,对该课程考试的改革应以培养学生的自主创新能力及动手实践能力作为切入点,根据学生的实际专业需求及个人能力的差异性对学生能力进行评价[1]。对专业成绩的评述不应单纯地以闭卷理论试卷成绩为最终成绩,应当综合评价学生日常课堂表现、实验课表现及课堂讨论等环节表现出的能力,并对成绩比例进行合理分配,具体考试方案由各专业教研部门自行确定。通过引入综述论文、课堂发言、实验课表现等环节的成绩评定,可以有效提高学生的学习兴趣。
(二)考试方法改革思路
对细胞生物学课程考试方法的改革,主要将考试成绩合理地划分为“闭卷理论考试(60%)+论文综述(10%)+实验课表现(20%)+日常课堂表现(10%)”四个部分。
1.对学生日常课堂表现进行评价
学生的学习活动以课堂学 因此,将细胞生物学课程考试成绩中的10%作为日常课堂表现的分值,主要对学生课堂参与程度、讨论问题积极性、师生互动与沟通、课堂出勤率等方面进行考察,从而有效地提高细胞生物学课程教学质量。
2.对学生实验课表现进行考核
细胞生物学课程主要由理论课及实践课构成,实践课教学可以有效地对理论进行验证,是学生深化理论、接触生物学领域的重要途径。传统细胞生物学课程的考试主要侧重期末闭卷考试的考试成绩,对实验课考核重视程度不足,导致绝大多数生物教师在教学过程中缺乏相应的重视。将细胞生物学课程考试成绩中的20%作为实验课表现的分值,可以有效地提升学生实验操作的积极性。
3.设计论文综述环节进行考评
为了提升细胞生物学课程的考评的合理性,可以设计相应的论文综述环节,对学生整体知识结构的掌握能力进行考核。论文综述环节可以在考试周前一周至两周进行,由教师提前布置相应的论文论述主题,给予学生充足的时间撰写论文、制作幻灯片,在考核过程中由学生自主上台进行论文汇报,再由其他学生进行自主提问。在评分过程中,可以将细胞生物学课程考试成绩中的10%作为论文综述环节的分值。
二、细胞生物学课程考试改革应注意的问题
(一)加强相关教师的素质培训
随着新课程改革的深化,虽然学生成为课堂教学活动的主体,但教师仍然处于主导者地位,教师的职业素质及教学观念直接影响细胞生物学课程考试方法改革的贯彻效果。因此,为了保证细胞生物学课程考试改革的有效性,我国高校相关专业应当开展周期性培训,培养生物教师相应的职业素养,相关专业教研室应根据教学活动的推进对教师进行跟踪性的培训,积极开展教学前期培训、教学中期检测及教学末期总结,保证生物教师可以明确细胞生物学考试方法改革的必要性,并从考试改革入手提高课堂教学质量。
(二)贯彻落实相应的考核操作
在明确了细胞生物学课程考试方法改革的原则与思路之后,应当将相应的方案与思路落实到实践中,用实践检验理想化的方案,提高细胞生物学课程考试方法改革的合理性[2]。在实际考核操作过程中,教师应当制定相应的规章制度明确相应的考核流程,并对学生课堂表现、课堂出勤情况等评价因素进行了解。在实际考核过程中,可以打破传统单一性由教师评价学生的教学模式,引入相应的学生互评、学生自评评价机制,尊重学生实际能力的差异性,对学生成绩进行合理的评估。
(三)在考核过程中加强教师的协作
由于细胞生物学课程考核具有较强的专业性及理论性,且考试改革涵盖面与考察面较为广泛,学生成绩考核工作难以由一个教师单独完成,因此应当以过程性目光看待细胞生物学课程考核工作,加强各环节教师的协作与沟通。在学生成绩评价过程中,由不同的教师负责学生日常表现统计、学生论文综述情况、学生试卷批阅等环节。在过程性评价中教师之间进行合理化分工,可以有效提升学生成绩考核的合理性。
(四)引导学生注重日常学习过程
细胞生物学课程考核不仅具有检测教学成果的功能,还具备评价功及引导功能[3]。传统侧重期末考试成绩的考核模式对教学成果的评价较单一,很容易导致学生陷入学习时仅注重考点的学习误区。对细胞生物学课程考试方法的改革对学生日常表现、实验课表现等方面进行综合考核,因此教师应当注重引导学生的日常学习课程,尽可能地消除功利性的学习目的。
总而言之,细胞生物学不仅是一门集理论性、创� 在教学考核过程中,相关教师应当明确考试的评价功能及引导功能,树立素质教育理念,利用多种形式的综合性考核内容对学生学习情况进行考评。
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此文系基金项目:2015年普通高校教学改革项目,编号:湘教通[2015]291号-554。
医德教育不只是人文社科类教师的职责,而是全体教师的职责,医德教育应贯穿渗透于整个专业教育中。在医学细胞生物学实验课中,时刻加强学生医德医风的教育。比如,在实验操作中教育学生认真细致,因为将来他们面对的是鲜活的生命,他们在对病人的诊断和手术操作中不容许一点失误,否则将会造成无法弥补的后果。因此,在实验课上要求学生每一步操作都要小心翼翼,将实验操作想象成对病人的手术。另外,一些学生在写实验报告时出现错别字,不善于总结分析实验结果,这时要提醒学生在未来的工作中一旦病例上出现错误或者没有对病人的病情进行认真的分析都可能导致严重的医疗纠纷。通过这些在实验课中发现的问题教育培养学生一丝不苟、严谨细致的工作态度,提高医学生的整体医德医风。
2教学方式的改革
兴趣是学习最好的老师,但是现在单的教学方式往往使学生处于被动地位。因此,改变学生的学习地位,配合多元化的教学方式来调动学生学习的积极性成为亟待解决的问题。
2.1变被动学 许多学生在实验过程中不知前因后果,只是草率结束实验,课后将实验内容抛之脑后,一无所知。为调动学生的主观能动性,在实验开始前,只是简单介绍相关的知识,提出实验目标。然后由学生在课下预习实验内容,查找资料,熟悉每一个实验步骤的原理、所需试剂的作用及配备方法,做好充足的准备工作。在实验结束后,分组讨论在实验过程中出现的问题,及对结果的多样性进行分析,鼓励大家畅所欲言,探讨该次实验内容能够用于解决哪些实际的问题。最后,要求学生认真整理出一份实验报告。在整个实验过程中,老师只起到引导、鼓励及评价的作用,而使学生处于主动地位。突然之间的角色转变使很多同学学习起来有些吃力,但是坚持一学期下来,发现学生的自主学习能力明显提高,这正是“授之以鱼,不如授之以渔”。
2.2变传统教学为多元化教学
现在一些高校的实验课教学方式仍为传统的板书讲解,这种教学方式早已不符合时代的发展。为使学生更直观生动的了解实验过程,将实验过程制作成录像,上课前通过多媒体播放教学示范录像。例如,对于原代培养细胞实验,前期的准备工作繁琐,耗时长,不可能每个同学都参与,这时通过播放教学示范录像[6],使学生深刻了解整个实验的来龙去脉。另外,在实验课上由“老师讲”变为“学生讲”。课前要求学生预习实验目的、原理及注意事项等,上课时随机挑选学生为大家讲解,其他同学对讲解的内容进行补充和纠正。在显微镜的使用实验课中,将学生分为2~3人的小组,小组中的每位同学分别操作显微镜,其他同学在旁观看,指出这位同学在操作过程中存在的问题,进而加深学生对显微镜使用方法及注意事项的印象。
3考核方法的改革
随着对实验课的重视程度提高,实验课成绩在总成绩中所占比例也相应增加。实验课的考核不再只依靠实验报告,而在于对学生实验原理的掌握及实验操作能力的评价。通过课前提问形式,了解学生的预习情况并给予一定评分。在实验课结束时,随机抽取部分学生,考核其对该次实验中关键技术的掌握,如显微镜、离心机、天平等仪器的正确使用及临时装片的制备,并叙述在操作过程中的注意事项等,从而对学生的操作技能进行测试。另外,在批改实验报告时,主要依据学生对实验数据的分析及总结程度给予评分,强化学生的分析思考能力。
4结语
医学细胞生物学实验课程开展的目的不仅在于验证课堂教学理论,更重要的是培养学生的科研思维及动手操作能力。这促使我们调整教学内容,满足不同层次学生的学习需求;更新教学手段,激发学生的学习兴趣;完善考核体系,公平全面的评价学生。同时,在整个实验教学过程中,不断提醒加强学生的医德医风教育,以提高学生的整体素质。只有通过全面深入的教学改革,才能培养出高素质、高层次的医学人才。
【关键词】细胞生物学;教学;改革
21世纪是生命科学的世纪,生物产业的开发需要生物学的发展。我国在基础科学发展规划中, 把细胞生物学、分子生物学、神经生物学和生态学� 细胞生物学目前已� 为适应新形势下的教学要求,围绕大学生实践和创新能力的培养,结合自己多年的《细胞生物学》课程的教学实践与经验,对细胞生物学课程教学内容、教学方法及课程考核方法进行了合理的改革,并取得了明显成效,为进一步提高大学生教学质量和人才培养水平提供参考。
1 教学内容的改革
突出教学主线。《细胞生物学》课程内容多,教学过程中容易出现主线不清晰,使得学生感到内容多而乱,不容易系统地理解。如何在有限的时间内让学生熟练掌握该课程的原理和方法并能应用到实践中� 比如我校生物技术专业选用了翟中和主编的《细胞生物学》第三版作为主要参考教材,全书分为15章,内容较多。我们在讲解的时候,从课程的体系出发,以真核细胞三大 将所有部分分为膜系统(第一章到第八章及第十五章内容)、骨架系统(第九章内容)和遗传系统(第十章到第十四章内容)三大系统。
整合教学内容。《细胞生物学》课程内容多且与其它学科的交叉广,教学过程中容易出现内容重复、轻重不分的情况。针对这些特点,细胞生物学老师在讲解过程中必须合理整合教学内容,如前八章的内容可以从膜系统相关性来讲,不管是物质代谢、能量转换、还是信号传导都是发生在细胞的膜上,这样联系地讲解起来便于学生更好的理解和接受。另外,《细胞生物学》课程与其它课程,如微生物学、生物化学、遗传学、分子生物学等课程的内容相互联系、相互渗透。因此,在该课程的讲解过程要合理整合教学内容,避免与先行课中某些内容重复,又要为后续课程留有余地,在学生头脑中形成细胞生物学的联系性、统一性和辩证的学习方法。实践证明,这种承前启后的教学方式,既保持了细胞生物学课程的完整性、系统性,又解决相关课程间的重复教学问题,对提高单位时间内的教学效果,激发学生的兴趣具有积极作用[4]。
追踪学科前沿。《细胞生物学》课程发展快,因此,教学内容是否新颖,对提高教学质量具有重要影响。《细胞生物学》的教师需要站在该学科领域的前沿,不断更新自己的知识,并及时把该领域的发展趋势、研究热点和应用价值归纳总结后在相关的章节中进行讲授,从而来提高学生对该课程重要性的认识、产生浓厚的学习兴趣、激发起学生对该课程的学习积极性。
2 教学方法的改革
全面推行“问题式”教学法,激发学生的学习兴趣与主动性。强调以培养学生发现、分析、解决问题的能力为主要目的。“问题式”教学方法的正确使用对于提高学生的素质,强化学生学习的兴趣,调动学生的主观能动性,培养学生的创新能力有积极作用。课堂教学是教学过程的主要环节,兴趣是最好的老师,浓厚的兴趣可以转化为强烈的学习动力和创造性。在教学过程中,我们要自始至终都围绕问题而展开教学活动,激发学生自觉思考、和主动探索,引导学生不断发现现象、提出问题、分析问题并最终解决问题,培养学生的创造性思维。
课后小论文,提高学生的综合应用能力。可以一个学习小组或一个宿舍集体为单位,进行课后小论文。在一些重要章节讲解介绍后,为了巩固学生的理论知识和培养学生的知识应用能力,课后布置一些相关的论文题目,通过学生的查阅文献、设计方案、过程操作、结果分析和论文写作等环节。同时,可以提高学生学习的主动性,对以后的科研训练和毕业设计的文献综述写作大有帮助。
加强课程实践环节。细胞生物学是一门试验性很强的学科,光是“听”和“读”是不够的,在努力提高课堂教学的同时,必须加强实践环节,开设一些综合性实验。实践教学是培养学生的动手能力、基本科研能力和创新能力的重要手段。找出与本课程的实践结合点,培养对知识应用的能力,在设计实验的时候、一改以往有的单纯的、验证性的实验,开设一些具有设计性的综合实验,使得学生在实验设计、过程操作和结果观察与分析中了解该课程的内容,并对整个研究内容有一个全面的、深入的学习,培养综合应用能力和创新意识。对于有科学研究的教师,要鼓励一些对科研感兴趣的学生参与自己的一些课题。一般到大三时候,学生完全可以利用他们学过的一些专业基础理论设计一些他们感兴趣的小实验,通过他们的收集资料、设计方案、实验过程和结果分析的全过程,大大提高其科研创新能力。
3 考核体系的改革
树立科学的考核观,使课程考核过程化。课程考核不仅要检验学生对理论知识的掌握,更应该评价学生综合应用知识的能力。课程最后成绩包括考试成绩(50%)、实验成绩(30%)和平时成绩(20%)。课程考核过程化不仅有助于理论知识的掌握,还能起到引导学生勤于思考、善于发现问题、启迪学生创新思维的作用;实施多元化的考核方式,把考核有机融入教学的全过程,促使“教、学、考”有机结合,形成“教、学、考”互动,调动学生学习积极性和创造性,消除部分学生平时松懈、考前背诵、考试作弊、考后√★√遗忘的不良现象。
通过对细胞生物学课程教学体系的研究与探索,我们对细胞生物学课程的教学内容、教学方法、课程考核方法进行了合理的改革,优化改革后新教学体系已在生物技术专业的细胞生物学教学中应用,并且取得了良好的效果。
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一、教学目标
【知识与技能目标】
1.概述细胞膜的成分和功能,体验制备细胞膜的方法。
2.理解细胞膜作为系统的边界,对细胞生命活动具有重要意义。
【过程与方法目标】
通过观察利用哺乳动物红细胞制备细胞膜的实验,提高科学实验设计的严谨性,增加概述和归纳总结能力。
【情感态度价值观目标】
认同细胞膜作为系统的边界,对细胞生命活动具有重要意义。
二、教学重难点
【重点】
细胞膜的成分和功能,体验制备细胞膜的方法,细胞膜对细胞生命活动的重要作用。
【难点】
细胞膜对细胞生命活动的重要作用。
三、教学过程
环节一、导入新课
1.老师展示地球与宇宙、中国与外国、生物与外界环境、细胞与外界环境、细胞的结构图,提问:
(1)地球与宇宙的边界是什么?
(2)中国与外国的边界呢?
(3)生物与外界环境的边界呢?
(4)细胞与外环境的边界呢?
(过渡语)细胞作为一个基本的生命系统,它的边界就是细胞膜,今天我们就一起学习系统的边界——细胞膜的结构和功能。
环节二、新课教学
研究细胞膜的化学组成,首先要把细胞膜与细胞的其他组分分开,怎么样获得细胞膜呢
(一)细胞膜的成分
1.体验制备细胞膜的方法
(1)学生思考要制备细胞膜,应该选择什么细胞作为实验材料呢?PPT呈现植物叶肉细胞、神经细胞和哺乳动物成熟的红细胞的图片?请学生选择并说明原因,之后PPT呈现人体正常的红细胞,人的圆涨的的红细胞和人的涨破的红细胞图片
(2)确定了哺乳动物的红细胞作为实验材料,那又该选择什么方法制备细胞膜呢?PPT呈现3种方法:①用针扎破,让细胞的内容物流出?
②用镊子把细胞膜剥下来?
③细胞内的物质是由一定浓度的,如果把细胞放在清水里,水会进入细胞,把细胞涨破,细胞内的物质流出来,这样既可得到细胞膜。
(3)确定了实验材料和试验方法,该如何做实验呢,学生看教材“实验”这一模块,思考总结实验步骤,并在大屏幕呈现人正常红细胞和光镜图片和人部分红细胞已涨破的光镜照片。
思考如果上述实验在试管中进行,细胞破裂后,还需要用什么方法才能获得较纯的细胞膜?
2.细胞膜的组成
(1)PPT呈现材料:①19世纪末,欧文顿曾用500多种化学物质对植物细胞的通透性进行上万次实验,发现细胞膜对不同物质的通透性不一样:凡是可以溶于脂质的物质,比不能溶于脂质的物质更容易通过细胞膜进入细胞。
②人的消化液中含有很多能够水解蛋白质的物质,用这种物质处理细胞膜,会使细胞膜分解。学生阅读这两段材料得出结论:细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。
环节三:总结与收获
教师带领学生回顾本堂课重要知识:制备细胞的材料、方法;细胞膜的成分
作业:细胞膜具有怎样的作用?学生课下预习并查找资料
我经常会让爸爸带我去原山国家级森林公园游玩。有一次,我无意间发现,在秋天,有一种树的叶片是红色的。爸爸告诉我,这是枫树,到了秋天它的叶片就会变红。不过这里的枫树还没有省级自然保护区潭溪山的红呢!我百思不得其解:为什么其它树木都变黄了,而它却变红了呢?带着这个疑问,我去请教家里的“百度爷爷”。
终于,我找到了答案:秋天枫叶变红,有内外两方面的因素。使叶片呈现红色的主要靠两种物质,一种是胡萝卜素,是普遍存在于叶绿体中的橙红色色素,另一种是花青素,存在于液泡内的细胞液中,当细胞液为碱性时,花青素呈蓝紫色,当细胞液呈酸性时,花青素呈红色。入秋以后,枫树叶内的花青素增多,而气温的下降又使叶绿素破坏消失,因此绿叶变成了红叶。变色的外部因素是气候条件:当气温迅速下降到一定程度,而且夜间的温度比白天下降很多时,树叶还没有凋落,而叶绿素已大部被破坏,同时昼夜温差的增大,也有助于花青素的形成,因此叶子很快变红。如果气温下降很慢,而且昼夜温差不大,叶绿素还没有被破坏而树已经枯萎,那就变不成美丽的红叶了,枫树叶里的糖分也起了很大作用呢!
枫树里的糖对枫树叶变红有关系吗?于是,我做了个小实验,我先从山上采下几片绿色的枫叶,把它们分别泡在有糖份和没糖份的杯子里,泡了五天。五天后,有糖水的杯子里的枫叶变红了,只有水的杯子里的枫叶还是绿色。实验证明:枫树里的糖份对枫叶的变红有很大关系!
真是“实践出真知”啊!
1胚胎干细胞概述
ESCs的生物学特性 ESCs是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(inner cell mass ,ICM) 或原始生殖细胞(primary germ cell , PGC)经体外分离,抑制分化培养获得的一种二倍体细胞。这类细胞在适宜培养基中可无限增殖并保持未分化状态,具有多向分化潜能,在体内体外都可形成广泛的细胞类型[2,3]。它具有以下特性: ①ESCs具有分化的多潜能性在体外可诱导分化出属于3个胚层的分化细胞;②ESCs具有种系传递的功能;③ESCs具有长期的未分化增殖能力,细胞不仅能分化成各种器官组织而且能增殖生成新的保持同种性状的ESCs;④ESCs易于进行基因改造操作;⑤ESCs保留了正常二倍体的性质且核型正常。Thomson等建立的五株ESCs在体外经过4~5mo未分化增殖,依然保持分化形成滋养层及所有三胚层组织的能力,将ESCs注射到SCID小鼠,小鼠可形成含有三胚层组织来源的畸胎瘤。大多数哺乳动物ESCs细胞均表达较高的碱性磷酸酶(AKP)活性,而且表达高端粒酶活性,即使培养1a,传代300代仍具有高端粒酶活性[4]。未分化的人ESCs 除表达多潜能干细胞典型标记物如OCT4、AKP等外,还表达阶段特异性胚胎抗原3、4(SSEA-3,SSEA-4),高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-80、TG30、TG343,而未分化的鼠ESCs不表达SSEA-3或SSEA-4,但特异性表达SSEA-1,说明人类和鼠的胚胎发育过程存在着基本种族差异[5]。尽管以上细胞标记物没有一个是完全的特异性ESCs 标记物,但作为整体出现与ESCs未分化状态却有密切联系[2]。ESCs在体外可以扩增,又能维持不分化状态和发育全能性,可对它进行遗传操作,因此,是进行细胞移植治疗的良好种子细胞。然而,明确控制胚胎干细胞向特定细胞分化的基因和环境信号,以及胚胎干细胞移植的组织相容性仍是一个难题,还需大量的实验和 理论 研究。
ESCs的信号转导 在小鼠的ESCs研究中人们已经发现了两条各自独立的干细胞分子信号转导通路:白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF)通路和Oct4通路。它们在保持细胞多能性及支持其未分化状态的生长有重要作用。研究表明,LIF通过与gp130-LIF 受体结合来激活转录因子STAT3( signal transducer and activator of transcription 3)从而来支持ESCs的分裂增殖。但最近有人报道:活化STAT3 信号能维持鼠ESCs的多能性,但LIF/ STAT3 信号通路不能维持人ESCS的自我更新及多能性[6,7]。Oct4是一种POU-V相关的DNA结合转录因子,它与小鼠全能细胞的表型有关。进一步的研究证明,Oct4可阻止ICM向体细胞分化,是胚胎 发展 期保持细胞处于未分化状态的关键因素。另有研究表明,转录因子Nanog在保持啮齿类动物的ESCs处于未分化状态中也起一定的作用。Nanog的表达比Oct4稍晚一些,对于保持ICM及ESCs的未分化状态有重要意义。
2胚胎干细胞在眼科的研究现状
胚胎干细胞与角膜 严重的眼表疾病如Stevens-Johnson综合症、化学性烧伤等,可以引起角膜缘上皮细胞缺失,导致球结膜上皮化、角膜新生血管形成和结膜瘢痕,最终导致视力丧失。虽然 目前 自体角膜缘干细胞移植[8]和口唇粘膜[9]移植可以成功的进行眼表重建,但一些严重的眼表疾病如Stevens-Johnson综合症,通常是双眼发生病变,且口唇粘膜同时受累,因此,将ESCs诱导形成角膜缘干细胞,为治疗此类疾病提供了新的思路。王智崇等[10]用表层角膜缘基质接触诱导ESCs,在体外分化成为单一形态的较大细胞,裸鼠皮下移植后形成细胞复层, 电子 显微镜发现细胞核呈扁平状,细胞表面有微绒毛结构,符合角膜缘干细胞的部分形态学特征,而体外培养条件下,角膜基质剥离面的ESCs细胞仍保持其小细胞状态不变,未经表层角膜缘基质诱导的ESCs细胞裸鼠皮下注射后分化为畸胎瘤样结构,表明表层角膜缘基质的这种微妙的调节微环境具有诱导ESCs细胞定向分化为角膜缘干细胞的潜能。2001年,喻瓴等将大鼠ESC 细胞与兔角膜缘上皮细胞共同培养以诱导其分化,结果由ESCs分化出的细胞具有上皮细胞表型,并且还表达角膜上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白K3/ K12[11]。最近,Homma等[12]将小鼠ESCs用Ⅳ型胶原接触诱导后形成上皮祖细胞,其角膜上皮细胞特异性标记物K12表达阳性,鳞状上皮细胞标记物K14表达阴性。然后将诱导后的上皮祖细胞移植到以n-庚醇制备的角膜损伤小鼠模型,移植后24h可见受损角膜重新上皮化,修复细胞来源于移植的干细胞。有趣的是部分移植细胞呈现基底细胞或翼细胞外观,说明移植细胞同时出现了非角膜上皮细胞的特性。由此可见,对于双眼完全性角膜缘干细胞缺乏的病例,ESCs很有可能为角膜缘干细胞移植和眼表重建提供充足的细胞来源。
胚胎干细胞与晶状体 目前,人工晶状体植入在白内障治疗中得到世界范围的广泛应用,其手术 方法 的安全性是明确的,但是术后的调节 问题 一直没有得到很好的解决。2003年,国外研究者[13]以基质细胞来源的诱导活性(stromal cell-derived inducing activity, SDIA)为诱导剂,诱导猴ESCs分化成晶状体细胞,20d后细胞聚集成群,最终形成不同大小的透明体,具有三维结构,免疫组化和Western blot检测显示αA晶状体蛋白和Pax6阳性。一些细胞群内可见色素上皮细胞的存在。同时,晶状体细胞的数量随FGF-2浓度和ESCs集落密度的增加而增多。因此,将ESCs诱导成晶状体细胞,植入到晶状体摘除术后的囊带内,是替代人工晶状体治疗白内障的一个可能途径,而且可以很好的解决术后调节问题。
3存在 问题
总之, ESCs的自身 应用 优势虽然为难治性眼科疾病的治疗提供了新的途径,但也存在着大量有待解决的问题。因此,阐明ESCs的定向分化机制、明确向目的细胞分化的诱导条件、基因修饰ESCs将是未来ESCs研究的发展方向。
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关键词 博士培养 二级学科 高等教育 要领剖析 规划设想
中图分类号:G642 文献标识码:A
0 前言
为培养和激励研究生的创新精神、促进高层次创造性人才的脱颖而出,教育部从1999年起在全国范围内开展评选百篇优秀博士学位论文的工作,至今已历时13届。 其获奖数量已成为衡量高校博士研究生创新能力、学科发展水平及博士生整体质量水平的一个重要指标。①因此,对生物学获奖的学位论文进行研究,总结获奖论文的特点并提出相应的建议,对生物学科的发展乃至研究生的教育培养,都具有极其重要的指导作用和现实意义。
1 全国优秀博士学位论文评选方法
全国优秀博士学位论文评选工作是在教育部和国务院学位委员会领导下,由教育部研究生工作办公室负责组织进行。参评的材料除参评学位论文外,还包括最多5项代表性成果以便专家评议核查,其成果必须与该学位论文内容密切相关,且为攻读博士学位期间及获得学位后一年内获得。
2 生物学1999-2010年全国优秀博士学位论文类别分析
(1)从二级学科情况来看,1999-2010年的12届评选中,生物学共入选72篇,其中生物化学与分子生物学专业入选最多,有18篇(占到总数的26%),其次是神经生物学专业入选13篇,再是细胞生物学专业10篇和遗传学专业8篇,其他的专业都只有零星的几篇获选。
本文主要针对2006年-2010年的获奖论文,进行针对性的比较分析,以刊物影响因子作为相对参考依据(只列入影响因子大于7的第一作者及共1作者)的二级学科分析如下:
以生物化学与分子生物学为例,2006-2010年共获奖6人(见表1),其部分信息如下:
同理分析神经生物学、细胞生物学、遗传学、发育生物学和生物物理学等。
分析数据表明,生物化学与分子生物学、神经生物学和细胞生物学这三个二级学科占据绝对的优势。正是这三大学科所具有的重要性吸引了很多优秀的研究人员,并且催生了多篇优秀博士论文。
(2)从学位授予机构来看,中国科学院上海生命科学研究院以总数21篇遥遥领先于其他单位。北京大学、复旦大学和中国科学院生物物理研究所各有6篇获奖,其余的单位都只有1-2篇入选。
(3)从论文的指导教师来看,存在多篇获奖论文的指导老师是同一名教师的“集聚”现象。其中,来自中国科学院上海生命科学研究院的蒲慕明和段树民的团队共获选了6篇(神经生物学)。中科院上海生命科学研究院的裴钢指导的团队(细胞生物学)、上海交通大学(原中国科学院上海生命科学研究院)的贺林指导的团队(神经生物学)和北京大学的翟中和指导的团队(细胞生物学)都表现得非常突出,分别有3~4篇的获奖论文。
3 生物学1999-2010年全国优秀博士学位论文特点分析
结合自然科学类的全国优秀博士学位论文评估指标体系和上述类别分析的结果,可以总结出下述特点:
(1)在Science 、Nature、Cell等顶级刊物上以第一作者身份发表了相关支撑性论文。
例如2010年获奖的王强、毛颖波、张柯,2009年获奖的丁昇等等。
(2)选题为本学科前沿研究热点和难点问题,具有较大的现实意义和理论意义。
例如管沉冰(2009年)的学位论文“从生长锥到胞体的长距离钙离子信号介导Slit-2引起的神经细胞迁移的翻转”,是目前国际上非常活跃的研究领域,对于研究神经损伤修复的手段有极大的意义。
(3)论文在理论上或方法上有创新,具有开拓性,探索了有价值的新现象、新规律,提出了新命题、新方法,对本学科发展做出了贡献。
例如丁昇(2009年)的“piggyBac转座系统——哺乳动物遗传分析的新工具”,改造了一种来源于粉纹夜蛾的DNA转座子piggyBac(PB),为在哺乳动物和其它脊椎动物中建立一个作为多功能遗传分析工具的高效转座系统迈出了关键性的第一步。
(4)论文研究成果的应用将取得显著的社会效益和经济效益。
例如毛颖波(2010年)的 “棉酚诱导的棉铃虫P450 GIP的分离鉴定和功能研究”,首次将RNA干扰与植物对昆虫的防御途径联系起来,Nature称之为“RNA干扰杀虫剂”。这一成果引起了社会和学术界的广泛关注,已和孟山都公司签署了合作意向。
(5)论文内容充实饱满、系统性较强、研究全面。
例如龚骏博士(2007年)的“青岛沿海管口目纤毛虫的分类学研究及科属级阶元的系统修订”,系统地对约40个已知属级阶元及同物异名进行了全面的新定义及清理,进而对目内系统做了新的修订。所以虽然发表的21篇支撑论文的影响因子都很小(都只有1左右),然而,博士学位论文因内容充实全面而获奖。
(6)论文语言表达准确、层次清楚,观点鲜明,重点突出,文字精练、图表规范、学风严谨,体现出较强的书写的系统性、逻辑性。
4 培养高质量博士研究生的相关建议
在全国优秀博士学位论文评估指标体系中,论文成果的创新性占了60%的权重。因此应着重创新性的开拓扩展,为自主创新提供适宜的环境。科研实践有助于博士生的创新意识和能力的锻炼和提高,参与国家“973”项目、国家自然科学基金项目等的研究工作都能为博士生创新能力的培养提供得天独厚的条件。
此外,可制订一系列鼓励创新的政策和措施,为博士生开展创新研究提供条件,鼓励创新,营造健康的学术氛围。
建议开展研究生导师经验交流会或优秀博士学位论文培育工作研讨会等,以促进导师的核心作用的发挥。指导学生所选课题应具有原创性,最好与国际前沿的热点或难点领域相关,或在传统学科与相关学科交叉的方向中寻找创新突破点,加大学科交叉力度。
注释
① 熊文,曹一雄,张淑林。以优博论文评选为动力促进博士学位论文质量提升[J].教育与现代化,2007(2):44-48.
【关键词】中草药
[关键词]中草药;组织损伤;白细胞黏附
LeukocyteadhesionandpreventionoftissueinjurywithtraditionalChinesemedicine
KEYWORDSdrugs,Chineseherbal;tissueinjuries;leukocyteadhesion
白细胞跨内皮迁移至血管壁间隙是组织损伤和炎症反应的必要步骤,白细胞与血管内皮的黏附是此过程早期重要的一步。白细胞与血管内皮黏附分子的相互作用是组织损伤和炎症反应过程的重要分子基础[1]。炎症的重要特征就是白细胞黏附。炎症时血管内皮细胞被激活而出现选择素分子,与白细胞膜上的配体反应,使白细胞在血管内皮上滚动。炎症性物质激活白细胞后,其表面的黏附分子受体即为激活型,血管内皮上的相应配体与白细胞对合,导致白细胞内皮细胞之间的强烈黏附,引起白细胞移动、趋化。白细胞和内皮细胞的黏附是有选择的。如急性炎症反应主要是中性粒细胞与血管壁的黏附,而慢性炎症反应则以单核细胞黏附为主。这是由于白细胞表达黏附分子的差异及细胞因子的不同调节所造成的[2]。另外,白细胞黏附功能异常将导致免疫功能下降,同样会引起炎症反应和组织损伤。中药可通过调节白细胞或内皮细胞表面黏附分子的水平来改善白细胞黏附功能,发挥抗炎作用,从而减少组织损伤。目前的研究主要集中在细胞间黏附分子1(intercellularadhesionmolecule1,ICAM1)及其配体的表达上。大致分以下四个方面。
1调节ICAM1表达,抑制白细胞内皮细胞黏附
ICAMl属于免疫球蛋白超家庭的成员,广泛地表达在各种血源性和非血源性细胞的表面,如白细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、某些肿瘤细胞、上皮细胞、平滑肌细胞等,可以接受各种因素的影响而呈诱发性表达。这些诱发性因素包括致炎性细胞因子以及高血压、缺氧和缺血再灌注等。ICAMl能通过与其配体β2整合素淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocytefunctionassociatedantigen1,LFA1)和白细胞受体alphaMbeta2(Mac1)/(CD11b/CDl8)的结合而促进T细胞活化及白细胞从血管内向炎症部位浸润,有助于炎症和免疫反应。
缺血再灌注损伤是组织损伤的机制之一,黏附分子的作用是缺血再灌注的病理分子基础,中药调节黏附分子的表达可能是治疗缺血再灌注损伤的机制之一。正常情况下,脑内ICAM1表达水平很低;脑缺血再灌注时,脑微血管内皮细胞上ICAMl等黏附分子表达上调,介导白细胞内皮细胞黏附,促进循环白细胞迁移进入脑实质,导致炎症性脑损伤,多种抗黏附策略对脑缺血再灌注损伤均有保护作用[3],应用ICAM1单抗亦能明显减轻缺血再灌注鼠脑组织损伤[4],表明ICAM1在脑缺血后白细胞介导的脑缺血早期炎症损伤机制中发挥重要作用。用灯盏花素50mg/kg和75mg/kg治疗,能减轻脑水肿,降低髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性和抑制ICAM1表达,从而减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑水肿和中性粒细胞浸润[5]。海风藤新木脂素类成分也可以通过下调ICAM1及其mRNA的表达来减轻脑缺血后的炎症性病理损害[6]。粉防己碱可抑制ICAM1mRNA的转录和核因子κB(nuclearfactorκB,NFκB)的激活,抑制脑缺血/再灌注后中性粒细胞的募集[7]。总之,中药可通过下调ICAM1及(或)其mRNA的表达来发挥脑保护作用。ICAMl也是肾脏缺血/再灌注损伤所致急性肾衰竭的一个关键介质,可能的作用是强化中性粒细胞和内皮细胞间的相互作用。肾脏缺血/再灌注损伤后ICAMl表达明显升高,主要在肾小球的内皮细胞,正常肾脏表达水平较低。活血化瘀注射液Ⅰ号和丹参均可抑制肾脏缺血再灌注损伤后肾组织ICAMl的表达,使肾脏ICAMl表达水平降低[8]。ICAMl、诱生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNFα)均受NFκB调控[9]。参附注射液可通过抑制NFκB的活化,减少ICAM1、iNOS和TNFα表达而起到减轻再灌注期间肠黏膜损伤的作用[10]。
中药还可通过调节ICAMl的表达,实现神经保护。Del等[11]证实,大鼠脑出血后,脑内嗜中性白细胞反应造成血肿周围神经细胞损伤。Gong等[12]发现脑出血大鼠血肿内及血肿周围出现炎症反应,其特征为中性白细胞和巨噬细胞浸润,小胶质细胞活化及ICAM1表达上调。经中药脑溢安(羚羊角、钩藤、三七、天竺黄、丹皮、地龙、牛膝、生地黄、大黄等)治疗12h后,大鼠出血侧脑内ICAMlmRNA及蛋白表达明显下调,相应区域的中性白细胞浸润及神经细胞损伤也显著减轻[13]。
2降低可溶性ICAM1表达,改善白细胞黏附功能
细胞黏附分子(cellularadhesionmo1ecule,CAM)是位于多种细胞表面的一类大分子糖蛋白,它通过介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的黏附作用参与一系列生理、病理过程,发挥重要作用。在一些因素作用下,细胞黏附分子可以从细胞表面脱落进入血液循环,形成可溶性细胞黏附分子(so1ublecellularadhesionmo1ecule,sCAM)。Kishimoto等[14]在研究中发现,中性粒细胞培养上清液中可溶性ICAM(so1ubleICAM,sICAM)的出现伴随着细胞表面膜型细胞黏附分子的丧失,故推测sICAM是由细胞表面膜型细胞黏附分子脱落而形成的。正常人血清中有低水平的可溶性ICAM1(so1ubleICAM1,sICAM1),它与位于细胞表面的配体结合后,可抑制细胞过度黏附,从而参与细胞黏附功能的调节。但生理情况下,sICAM1抗黏附作用很弱,仅有细微调节作用;而病理状态下,sICAM1水平升高,抗黏附作用显著增强,使白细胞黏附功能明显降低,从而导致免疫功能的下降。Komatsu等[15]观察到心肌细胞在正常情况下亦表达极少量sICAM1,普通免疫学方法无法检测到其存在。在心脏遭受严重损伤、心脏移植排斥反应、心肌缺血再灌注及TNFα等细胞因子作用下,心肌细胞膜表面sICAM1量可成倍增加。亦有人[16]将sICAM1水平作为充血性心力衰竭病情严重程度的重要监测指标之一。sICAM1表达减少可减轻白细胞之间及白细胞与血管内皮细胞之间的黏附,改善微循环[17],从而起到抗组织损伤作用。
3调节CD11b/CD18表达,抑制白细胞内皮细胞黏附
炎症反应中黏附分子表达上调及内皮细胞白细胞黏附增加是炎症反应发展的重要步骤,而多形核白细胞(polymorphonuclearleukocytes)的黏附分子CD11b/CD18介导此全过程[20]。正常情况下,CD11b/CD18仅在单核细胞和中性粒细胞膜上呈低水平表达。当病理情况下,其表达增加,通过与其配体――内皮细胞表达的ICAM1相互作用而介导白细胞与内皮细胞黏附,此为炎症的早期反应,是组织损伤的关键步骤。
近年来,众多的研究证实,动脉硬化过程是炎症反应参与的结果,抑制慢性炎症,可以预防血管病变[21]。2型糖尿病患者运用中药复方(生地黄、赤芍、川芎、当归、丹参、红花、山萸肉、山药、山楂、桑椹子、黄芪、太子参、葛根等)治疗后,不仅降低了炎症反应的细胞因子TNFα,抑制了多形核白细胞黏附分子CD11b/CDl8的表达,而且尿白蛋白排泄率(urinaryalbuminexcretionrate,UAER)的减少与TNFα降低及黏附分子CD11b/CDl8的表达下降呈正相关。因而认为,该中药复方可能是通过抑制白细胞的黏附、减少患者的炎症反应而发挥预防血管病变作用[22]。xxx等[23,24]观察了糖尿病大鼠大脑缺血再灌注后CD54和外周血中白细胞CD8及CD11b免疫阳性细胞数的变化,发现随着CD54、CD8及CD11b阳性细胞数的增加,中性白细胞的浸润也随之增加,在时程上与CD54的增加同步,用丹参治疗后CD54的表达水平和外周血中白细胞CD8及CD11b免疫阳性细胞数及白细胞的浸润明显降低。这一结果进一步证实:调节CD11b/CDl8的表达可抑制白细胞血管内皮细胞黏附,进而减轻组织损伤。
4调节淋巴细胞黏附功能,改善免疫功能
现已证明细胞间黏附的分子基础是细胞表面众多黏附分子的相互作用,在免疫反应发生时,体内产生大量白细胞介素1(interleukin1,IL1)、TNF等细胞因子,上调细胞表面黏附分子的表达[25],促进淋巴细胞与血管内皮细胞的黏附,从而进一步促进免疫反应。
调整淋巴细胞黏附功能是近年的研究热点之一。中药黄连、黄柏的活性成分小檗碱具有多方面的药理作用,如抗菌、抗炎、抗癌等。研究结果显示[26],小檗碱不仅能抑制静止的及IL1、TNF激活的内皮细胞与淋巴细胞的黏附,而且可抑制IL1激活的淋巴细胞与血管内皮细胞的黏附,此作用主要通过抑制内皮细胞ICAM1的表达来完成,提示抑制内皮细胞ICAM1的表达是小檗碱抑制淋巴细胞与内皮细胞黏附的分子机制之一。淋巴细胞与内皮细胞的黏附有除CD18ICAM1以外的黏附分子介导,如极晚抗原4(verylateantigen4,VLA4)与血管细胞黏附分子1(vascularcelladhesionmolecule1,VCAM1)等[27],所以小檗碱还可能通过抑制其他黏附分子的表达而抑制细胞黏附,也可能通过使淋巴细胞CD11/CDl8的构型改变而减弱与内皮细胞的亲和力[28]。黄芪是研究较多的另一味中药,其活性成分黄芪多糖(astragaluspolysaccharin,APS)具有抗感染、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等多种药理作用。晚近的研究表明黄芪多糖是通过其免疫增强作用而发挥功效的。黄芪多糖作用于人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalendothelialveincell,HUEVC)而不作用于淋巴细胞,通过促进HUEVC表面黏附分子ICAM1的表达而增强HUEVC与淋巴细胞黏附,促进淋巴细胞再循环,增强淋巴细胞与抗原的接触机会,从而扩大免疫反应,增强机体免疫功能[29]。
一般认为黏附分子是辅助性T细胞(helpTcell,Th)、细胞毒性T细胞(cytotoxicTcell,CTL或Tc)活化、增殖及完成各种功能的一个不可缺少的因素,而Th、Tc细胞是参与免疫反应的主要效应细胞,CD11a+、CD18+分子是其中重要的黏附分子[30]。用免疫方法复制炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)模型,结果表明,LTR、IL2、CD8+及T淋巴细胞表面黏附分子CD8+CD11a+、CD8+CD18+表达水平低下,与正常组比较,差异有统计学意义(P<),与人体发病相似。中药灌肠液(黄芪15g、大黄15g、黄柏15g、五倍子15g、白芨15g)可明显提高Tc细胞表面CD8+水平及其黏附分子CD11a+、CD18+的表达,提示中药灌肠可能是通过提高黏附分子CD11a+、CD18+在Tc细胞表面的表达,从而提高Tc细胞的活化、增殖及其各种功能[31]。
此外尚有中药同时作用于ICAM1和其配体,影响白细胞和内皮细胞的黏附分子的表达。商陆皂苷甲(esculentosideA,EsA)是一种从中药商陆(PhytolaccaesculentaVanHoutte)中提取的具有显著生理活性的三萜类皂苷。以往研究表明EsA有十分显著的抗炎作用。肖振宇等[32]观察了在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激条件下EsA对人脐静脉内皮细胞株HUEVC304及人中性粒细胞表达黏附分子的影响,发现EsA能显著降低HUEVC304细胞在LPS刺激条件下黏附分子ICAM1mRNA的表达水平,亦能降低人中性粒细胞在LPS刺激条件下黏附分子CDl8mRNA的表达水平。这些研究结果提示,影响白细胞和内皮细胞的黏附分子的表达是商陆皂苷甲的抗炎机制之一。
总之,调节黏附分子的表达可能是中药抗组织损伤机制之一。中药可以通过调节白细胞或内皮细胞黏附分子的表达,减弱白细胞内皮细胞黏附,抑制炎症反应,从而减少组织损伤,或调节淋巴细胞与内皮细胞的黏附,改善机体免疫功能而发挥抗组织损伤的作用。
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1.1教学内容现状
从1665年英国人RobertHooke用自己设计与制造的显微镜观察到栎树皮纤维质的细胞壁以来,细胞生物学这一学科得以形成。鉴于细胞生物学的发展是与其研究技术方法一起进步,电子显微镜技术、基因重组技术等技术的使用丰富了细胞生物学的内容,其研究内容由细胞显微水平至超微水平、分子水平。人类的癌细胞生物学、基因遗传学是现在医学研究的热� 目前,高等师范院校生物科学专业使用的细胞生物学教材基本有2种缺陷:一是医学专业使用的教材,对细胞的结构、功能介绍的层次太深;二是生物专业的教材罗列的知识面太广、缺乏深度,而且许多知识点与高中生的生物学知识重复。
1.2解决方法
为了培养具有科技创新型、高素质型新一代生物教师,严格依据本专业细胞生物学教学大纲、多个版本的细胞生物学教材及关于细胞研究的国内外时新文献等资料,量身定制式地撰写一本适合高等师范院校生物科学专业学生的细胞生物学课程讲义。其特色在于及时编入当年细胞生物界发生具有科研历史意义的文献资料及科学技术方法,重点放在细胞的系统构建及细胞模型制作等中学教学技能重点、难点上;略讲或删除中学已学的生物学相关内容;删除对细胞的结构、功能介绍的层次太深的知识及一些纯医药等其他专业的知识,使细胞生物学的知识保持系统性的同时具有适当的深度和广度。另外,为了培养启发学生自主创新能力、科研兴趣,要求学生课外每周阅读1篇近年的细胞生物学相关的研究性论文,定期在课堂讨论论文的设计和特点。
2教法研究
首先需革除传统的满堂灌和僵硬的概念式教学,采用课堂讨论主体互动式、与案例相结合的以问题为基础教学法(PBLcase)教学模式、多媒体技术等教学方法,并结合细胞生物学的研究发现事件为主线的前沿性学科教学方法,培养具有创新性、综合素质高的高等师范院校生物科学专业人才。
2.1PBLcase教学模式
PBL教学模式是以问题为基础的启发式问题教学,于1969年由加拿大麦克马斯特大学的美籍神经病学Barrows教授首次提出,直到1993年开始在全世界推广[1]。PBLcase教学模式就是在PBL问题教学模式中就其中的问题采用案例分析[2-8],具体步骤如下。2.1.1提出案例设计1个与教学知识内容密切的案例。PBLcase教学模式很适合细胞生物学这门课程,因为生物体的每种细胞都有自己生理活动现象及其细胞之间的相互生理关系,这些细胞生理现象就是案例的取材来源。2.1.2分析案例把学生分成小组分析案例并对不懂的或怀疑的知识点先进行探讨,师生再一起讨论,通过这种师生互动式、课堂角色互换等教学方式能够激发学生的主动思考、分析问题能力, 最后,将各小组的讨论结果进行分析总结,得出一个相对最佳知识答案[9-12]。2.1.3总结用理论知识解决案例的原理。将案例与整章各知识内容贯穿渗透,理论联系实际,用理论解决实际问题,达到理解记忆。
2.2充分利用多媒体课件
细胞生物学是一门概念性、抽象性,并与医学、生物学、农学等专业都交界相关的课程。这就要求授课教师根据教学实际需要,制作含视频、动漫、图片等技术手段具有生动性、趣味性特色的多媒体课件,以增强课题的气氛、提高学习效率和教学效率。将细胞的抽象性生理事件,通过使用多媒体课件将细胞的结构与生理现象图文并茂的展示给学生,使抽象的知识形象化、简单化。通常在讲述细胞的结构相关知识时使用插入图片的PPT课件讲述效果就很好。如讲述细胞周期时,用饼状图制作PPT课件。另外,讲述细胞的生理事件时可采用视频、动画或视频课件。如讲述细胞核糖体的组装及多聚核糖体蛋白质生物合成的过程时,用Flas课件来授课使得细胞核糖体的组装及多聚核糖体蛋白质生物合成的过程仅用5~7minFlas课件生动的展现,同时刺激了学生的视觉、听觉,还有场景效果也使其记忆深刻,对知识有了全方位的理解。反之,如果仅用普通PPT讲述细胞核糖体的组装及多聚核糖体蛋白质生物合成则至少需要35~45min,而且这种单纯视觉的记忆时间要比凭借视觉、听觉和场景的记忆差很多。
2.3建立学习兴趣小组
组建学习兴趣小组,定期开展学习细胞生物学相关知识的兴趣活动,授课教师对兴趣小组活动进行指导,如指导学生完成“核糖体模型的制作”、“细胞膜的结构模型制作”等。学习兴趣小组由各个组长负责指导组内学生学习和向教师反映学习情况及疑难问题,使学生的学习由原来的被动变为主动,这种学习角色的改变对提高学习积极性和学习效率大有帮助。简而言之,建立学习兴趣小组使教师对细胞生物学课程的辅导不但具有持续性,而且将师生的角色互换,在提高学习效率的情况下还能改善师生关系。重点是对培养高等师范院校专业的学生对课堂的设计过程及对将来自己设计课堂教学有重要意义。
2.4课程考核方式多元化
将原来单一的期末试卷测试考核方式改为每个章节提问分析说课、课堂外举办知识讨论会等贯穿整个教学过程的多元化考核方式。如教师在每个章节结束时对难点和重点知识向学生进行提问以考核学生听课效果并记录考核成绩;课堂外举办知识讨论会是为了相互讨论时挖掘知识的深层意义;对知识挖掘正确且有意义的学生加分,该分核算入细胞生物学期末终成绩中;另外,在试卷的题型中尽量多一些跨章节的题型及当年细胞生物学相关国际研究的新突破等内容进行综合分析之类题型。这样学生在整个学习过程中一直有对教学内容有着自己的见解,对提高学生细胞生物学课程专业知识水平、教学技能及生物科研能力均有很大提高。
3教师团队建设
细胞生物学课程固定由多名相关专业教师授课,组成细胞生物学教师团队[13-15]。细胞生物学的教学大纲、教学进度、教材的使用、上课具体内容都严格经团队教师统一探讨并修改。这就保证了细胞生物学课程内容与授课质量。也为细胞生物学精品课程开设打下很好的基础。另外,课题组成员教师经常参加国内外细胞生物学学术研讨会,为细胞生物学的教学方法改进与内容的丰富等提供进一步的帮助。
4小结与展望
通过细胞生物学课程教学改革,本院细胞生物学课程教学质量比改革前有了很大进步,主要情况分析如下。(1)使用量身定制式撰写的高等师范院校生物科学专业学生的细胞生物学讲义,使生物科学专业的学生学习细胞生物学有一定的知识连接性;同时,教师团队建设为教师的相关专业知识增添知识源,使得知识完善、正确;(2)组建学习兴趣小组、使用多媒体教学、使用PBLcase教学模式、学生主体互动式、课堂讨论、考核多元化等方法,并结合细胞生物学的研究发现事件为主线的前沿性学科教学方法,培养了学生看论文及科研求证习惯,极大提高了学生学习兴趣及学习效率,使学生积极主动学习。建议在今后的细胞生物学教学中继续探索,以进一步提高高等师范院校生物科学专业细胞生物学教学质量。
细胞凋亡采用FITC-PI双染色方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液,每管加入10μLFITC溶液,避光孵育30min后,每管加入10μLPI溶液,C6流氏细胞仪每管抽取10000个细胞进行分析。实验重复6次。细胞迁移及侵袭能力采用Transwell小室方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液,以每孔100μL含51×10细胞数接种于Transwell小室的上室,下室加入500μL高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清),48h后取出小室,PBS清洗上室内的细胞,室温晾干后4%多聚甲醛固定30min,PBS清洗3遍,至于吉姆萨染色液中染色30min,取出室温晾干后,置于显微镜直接观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞个数。细胞侵袭能力检测需在Transwell小室的上室内预先铺置基质胶,置37℃、5%CO细胞培养箱中26h后备用,余步骤与细胞迁移实验相同。实验重复6次。统计分析用SPSS18.0统计软件对数据进行处理。实验数据用表示,两组间采用t检验,多组间采用单因素方差分析和Bonferroni检验,<0.05认为有统计学差异。
2结果
2.1U87来源的GSCs的鉴定
如图1A所示,U87细胞置于干细胞培养基培养后形成细胞球,此细胞球同时表达Nestin(神经干细胞标志物)及CD133(肿瘤干细胞标志物),在图1B中,细胞球在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行分化培养2周后,细胞表达胶质细胞活化的典型标志物GFAP,以及神经元的典型标志物tubulinIII。以上结果说明在干细胞培养基形成的细胞球细胞为典型的胶质瘤干细胞,具有神经系统肿瘤干细胞的特征,并且具有多向分化能力。
2.2在GSCs中,miR-144呈现低表达状态
如图2所示,Real-timePCR结果显示,与non-GSCs相比,在GSCs中miR-144的表达明显降低(<0.01),说明miR-144可能参与了脑胶质瘤的发生和发展。
2.3转染后,miR-144的表达
如图3所示,在pre-miR-144组中,miR-144的表达显著提高(<0.01),而在anti-miR-144组中,miR-144的表达显著降低(<0.01)。
2.4过表达miR-144降低GSCs的细胞活力
如图4所示,在pre-miR-144组中,GSCs的细胞活力显著降低(<0.01),而在anti-miR-144组中,GSCs的细胞活力显著提高(<0.01),但是在pre-NC组和anti-NC组中,GSCs的细胞活力与对照组比较无统计学差异。
2.5过表达miR-144促进GSCs凋亡
如图5所示,在pre-miR-144组中,GSCs的细胞凋亡率显著增加至15.6%(<0.01),而在anti-miR-144组中,GSCs的细胞凋亡率显著下降到3.6%(<0.01)。但是在对照组,pre-NC组和anti-NC组中细胞凋亡率分别为8.1%,7.9%和7.9%,三组间无统计学差异。
2.6过表达miR-144抑制GSCs的细胞迁移及侵袭
如图6所示,在pre-miR-144组中,细胞的迁移能力显著降低(<0.01),而在anti-miR-144组中,细胞的迁移能力显著提高(<0.01)。但是在pre-NC组和anti-NC组中,细胞迁移能力与对照组比较无统计学差异。此外,在细胞的侵袭能力检测中,我们得到了相似的结果。
2.7MiR-144靶基因的预测
如图7所示,我们经过查阅生物信息学预测软件Targetscan、Pictar和RNAhybrid等,发现有众多基因存在miR-144的结合位点,经查阅文献得知其中X染色体连锁锌指转录因子(ZFX)和酪氨酸激酶受体(TEK)与GSCs的发生展有着密切的关系。
3讨论
在人体内,miRNAs含量巨大且种类繁多,其典型作用为降解靶基因mRNA或抑制其翻译,从而参与调控人体内的各种生命活动。近年来关于miRNAs的研究逐步增多,其主要的研究方向主要在于探寻miRNAs在各种生命活动中的作用,但许多研究显示miRNA在不同的组织及细胞中表达水平有着显著差[10]异。尤其是在普通细胞和干细胞中,由于干细胞具有的特殊能力导致其细胞内的诸多生命活动都有[2]别于普通细胞,因此关于miRNA在干细胞生命活动的机制研究显得尤为重要,并为揭示干细胞的特性及其产生机制提供了直接可靠的证据。脑胶质瘤是公认的神经系统的恶性顽疾,也是被研究最多的神经系统肿瘤,更是在所有肿瘤中较早成功分离鉴定出含有干细胞的肿瘤之一,关于脑胶质瘤干细胞的研究主要集中在其干细胞特性的研究,有研究显示CD133和Nestin等因子是维持脑胶质瘤干细胞干性的[11,12]必须因子,因此这两种因子也被认为是鉴定脑胶质瘤干细胞的特征因子。研究显示miR-101及miR-152等可通过抑制其下游靶基因的表达从而抑制脑胶[13,14]质瘤干细胞的恶性生物学行为,这些研究为脑胶质瘤的治疗指引了方向。但是由于miRNA的种类繁多及数量庞大,需要不断的研究来补充完善各方面的数据, 故本研究着重探究miR-144在脑胶质瘤干细胞中的作用。进一步明确miR-144在脑胶质瘤干细胞中产生作用的可能机制,为脑胶质瘤的治疗提供新的方向及有效途径。在本研究中,我们成功分离鉴定了U87来源的GSCs,Real-timePCR实验结果显示与non-GSCs相比,miR-144在GSCs中呈现低表达状态,提示miR-144在脑胶质瘤的发生和发展中起重要作用。进一步的实验表明GSCs在转染miR-144mimics48h后,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著增加,细胞迁移及侵袭能力也同样呈现抑制状态。但是,在转染miR-144inhibitors后,我们通过上述实验观察到了相反的现象。以上结果有利的佐证了我们对miR-144在GSCs中起到了抑癌因子作用的推测,也为miR-144在GSCs中的抑制作用提供了可靠的证据。由于miRNAs的主要作用方式为降解靶基因mRNA或抑制其翻译,从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动,我们通过查阅生物信息学预测软件(Targetscan,Pictar,RNAhybrid),发现有许多基因含有miR-144的结合位点,意味着这些基因可被其降解,并同时产生某些生物学效应。在众多的靶基因中我们发现有几个基因参与调控了GSCs的恶性生物学行为,例如X染色体连锁锌指转录因子可以通过增加c-Myc的表达水平,增加DNA的复制及促进细胞的增殖,从而维持GSCs的干[15]细胞特性及促进其恶,又如酪氨酸激酶受体可与血管生成素1形成联合网络信号,介导GSCs与血管内皮细胞间的物质交换,并使俩者产生紧密的贴合,形成了脑胶质瘤发生发展的源头,并[16]为GSCs转移与侵蚀提供丰富的血液供给。以上只是我们发现的2个在GSCs中起到关键作用的miR-144的靶基因,但是细胞内的复杂联系是难以估量的,由此我们推断miR-144至少通过降解以上2个靶基因的表达,从而对GSCs的恶性生物学行为起到了抑制作用,但是是否还有其他的靶基因也参与其中,或是形成网络调节有待进一步的研究证实,本研究结果为脑胶质瘤的治疗提供新靶点。